学校班级School/Class：徐州市撷秀中学 高一（24）班

小组成员Names：齐潇然 王远博

指导教师Teacher：王佳佳 满卫萍

研究背景Background：蛋白质在科学研究具有中极其重要的作用，贯穿了生命科学，医学、化学、材料科学乃至基因工程等多个领域。科学实验需要干扰素伽玛，我们通过编辑基因片段植入大肠杆菌用于生产目标蛋白并纯化，此实验旨在检测生产出的干扰素伽玛是否符合要求标准。

目的与意义Purpose：在蛋白质纯化过程中，了解目标蛋白的等电点，疏水性，大小等特性，增进对蛋白质本身的理解。通过对蛋白质进行纯化及检测,保证其纯度，结构完整性和功能活性，为其他以此为原料的科研项目和工业生产奠定基础。

概述Overview：蛋白质的分离，提纯与鉴定是生物化学与分子生物学研究的基础。高效的纯化策略，旨在从复杂混合物中获得高纯度具有生物活性的目标蛋白，并对其进行准确鉴定。

本课题的核心流程通常包括细胞裂解，粗分级与精细纯化。首先通过超声没解或者去皱剂等方法，破损细胞释放内容物测温经常利用硫酸铵沉淀等快速浓缩目标蛋白，精细纯化则主要依赖柱层析技术，亲和层析利用标签与固定化酶特性结合，实现一步高效纯化；交换层析和尺寸排组层析则分别依据电荷与分子大小进行分离，能进一步提高纯度。

过程需要全程监控。SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)最常用的纯度与分子量分析工具。Western Blot利用抗原-抗体反应，可特异性鉴定目标蛋白，最终通过比色法或紫外吸收法定量蛋白浓度，并通过功能实验验证其生物活性。

综上，整合多种层析技术与检测手段，是获得高质量蛋白的制品服务于下游结构与功能研究的关键。

实验材料与方法（一）——目的蛋白的纯化

实验材料：亲和层析填料、EP管、50毫升离心管、纯化缓冲溶液，G250溶液、裂解缓冲液、平衡缓冲液、洗涤缓冲液（20毫摩尔咪唑）、洗脱缓冲液1（50毫摩尔的咪唑）、洗脱缓冲液2（100毫摩尔咪唑）、洗脱缓冲液3（500毫摩尔的咪唑）。

使用超声破碎仪对表达菌体进行裂解，离心收集含有目标蛋白的上清液。

01.样品处理：

使用超声破碎仪对表达菌体进行裂解，离心收集含有目标蛋白的上清液。

02.纯化

• 平衡： 将亲和层析填料装入重力柱，用平衡液冲洗5-10个柱体积。

• 上样：将样品上清加入平衡好的柱子

• 洗杂：洗去非特异性结合蛋白

• 洗脱：咪唑梯度洗脱目标蛋白。

03. 检测与透析

SDS-PAGE电泳初步鉴定纯化效果，透析去除咪唑。

实验材料与方法（二）——目的蛋白的浓度检测

实验材料：EP管、酶标板、10ul&300ul枪头、Bradford检测试剂盒、透析溶液

01. 标品配置

配制0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/ml蛋白标准。

02. 检测：将标准品和样品与Bradford试剂混合，用酶标仪测定A595。可测定吸光度。

03. 计算浓度：使用exccl表格中工具制定浓度为x轴，吸光值为y轴的拟合线性曲线，再将样品吸光值带入到曲线中，计算得到蛋白浓度。

实验材料与方法（三）—— Western Blot检测

实验材料：12%SDS-PAGE胶，离心管，小型摇床，10ul枪头、10XTris 缓冲液、1XTBST、10X电泳缓冲液、1X电泳液、10X湿转缓冲液、转膜液、 Westem blot封闭液(5%脱脂牛奶)、二抗稀释液

01. SDS-PAGE

通过电泳技术将蛋白质样品按分子量大小进行分离。

02. 转膜

利用电转印技术将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上

03. 封闭

转膜完毕后，用5%脱脂牛奶封闭膜上非特异性结合，放置室温摇床~60min。

04. 一抗孵育

封闭结束，孵育相应一抗，室温孵育1-2h，孵育完成后加入1XTBST 室温摇床洗膜3遍，每遍5min。

05. 二抗孵育

孵育对应二抗，放置室温摇床孵育1~2h，加入1XTBST室温摇床洗膜3遍，每遍5min。

06. 结果曝光

按 1:1 比例混合ECL化学发光液中A液和B液，均匀涂抹在膜上，使用曝光成像仪显像。

实验结果与分析（一）——SDS-PAGE结果

实验结论分析

上清：与目标蛋白结合

流穿：与目标蛋白结合

洗杂：与杂质蛋白结合

浓度20咪唑:浓度不足以把目标蛋白提纯

浓度50咪唑：浓度不足以把目标蛋白提纯[1]

浓度100咪唑：浓度足够提纯目标蛋白

浓度500咪唑：浓度足够提纯目标蛋白

（注：上清指的是工程菌经裂解液重悬、超声破碎后，经 12000rpm、4℃离心 30 分钟，离心管中形成的上层澄清液体）

图1：目标蛋白SDS-PAGE电泳检测图谱

实验结果与分析（二）—— 蛋白浓度结果

蛋白浓度测定 (Bradford法)

标准曲线拟合分析

基于标准品吸光度值绘制标准曲线，线性相关系数 R² =0.9627，表明标准曲线拟合度良好，可用于定量计算。

目标蛋白浓度计算结果

纯化后蛋白浓度：10.8 mg/ml

图2：吸光度值随目标蛋白浓度变化曲线图

实验结果与分析（二）——蛋白浓度与Western Blot结果

Western Blot特异性鉴定

结果分析：

在预期的分子量位置出现了清晰的特异性条带，无明显杂带，证实了目标蛋白的成功表达与纯化。

图3 Western Blot特异性鉴定

结论与展望

【实验结论】

·蛋白质成功表达

·目标蛋白纯化成功

·目标蛋白高纯度

·蛋白完整、无明显降解