DNA琼脂糖凝胶电泳的制备及影响因素探究

陈天奥 王昱栋 李宇翔 饶子豪 等

一、摘要

本小组实验的主题是DNA琼脂糖凝胶电泳的制备及影响因素探究，实验过程中采用了控制变量法，对照实验法等思想方法，认真进行各项实验，如实记录各项数据，实验结果较为成功，得到了琼脂糖凝胶电泳可用于分离分子，琼脂糖凝胶电泳的分离效果与电源电压大小以及琼脂糖浓度有关，琼脂糖凝胶电泳可用于分离DNA等实验结论。

二、关键词

琼脂糖凝胶电泳，色素分离，DNA分离

三、引言

当今社会发展迅速，生物技术、分子化学等技术在科技发展中的地位不断提升。电泳（electrophoresis）技术作为一项早在86年前就被应用的生物技术，一直伴随着社会的发展。如今，它已成为临床检验、实验诊断和分子生物学等学科必不可少的研究手段，尤其在血液、尿液、脑脊液或其他液体的蛋白质分离分析中，有着举足轻重的地位。现代电泳技术依赖着相关技术与仪器的改进，不断地朝着快速、高效、自动化的方向发展。

本小组对本实验产生兴趣时是在网上浏览时发现了有关电泳的信息并由此对电泳产生了兴趣，开启了一系列的探究性实验。实验中，本小组运用了控制变量法、对照实验法等思想方法，认真进行各项实验，如实地记录了数据，最终取得了较准确的研究成果。

本小组成员认为，琼脂糖凝胶电泳技术可广泛应用于细胞生物学、病毒学、免疫化学、动植物学、生物化学等学科中，使其获得长足的发展与进步。

四、材料与方法

1.琼脂糖凝胶电泳室的制备

1.1实验材料

长方体塑料盒（长11㎝，宽7㎝），两根金属丝，电工钳，电源适配器，两条鳄鱼夹，胶梳（尺寸见下图），美工刀，电子秤，两张垫纸，250ml烧杯，100ml烧杯，小苏打，琼脂粉，四种颜色的色素，四支0.2ml的滴管，药匙，玻璃棒，100ml量筒，蒸馏水等。

1.2实验过程

1.2.1制备凝胶电泳室

1.2.1.1准备一个长11㎝，宽7㎝的长方形塑料盒备用。

1.2.1.2按图示尺寸裁剪出至少三把具有至少四个梳齿的胶梳，将其卡在塑料盒短边一侧，保证胶梳可以牢固卡在塑料盒上，并与塑料盒底部留有至少0.2㎝的空间。

1.2.1.3用老虎钳剪下两根约10㎝长的不锈钢丝，在6㎝处向上弯曲钢丝，在7.5㎝处向下弯曲钢丝，然后把它们分别卡在塑料盒内长边的两段，与短边平行。

1.2.2制备小苏打缓冲液

用电子秤称量2g小苏打，倒进250ml的烧杯中，加入200ml的蒸馏水，充分搅拌，制成质量分数为1%的小苏打缓冲液。

1.2.3制胶板

1.2.3.1用电子秤称量0.5g琼脂粉，倒入100ml烧杯中，加入50ml缓冲液，振荡均匀，制成混合溶液，将其放入微波炉中，高火加热1min，每20s停止加热取出，搅拌至溶液内无气泡，确定全部琼脂粉溶解后，停止加热，取出置于耐热桌面上，待温度降至60℃ 左右时，即制成1%的琼脂凝胶溶液。

1.2.3.2将胶梳插入电泳室短边的任一侧，二者之间留出大约1㎝的空间，向放在水平桌面上的塑料盒中一次性轻轻倒入50ml凝胶溶液，使胶梳齿浸没0.5㎝，等待10-15min，确定溶液凝固成凝胶后，轻轻拔出胶梳。

1.2.4上样

在距离电泳室两侧短边0.5㎝的位置，用不锈钢药匙的后端将凝胶轻轻划开并取出长7㎝，宽0.5㎝，高0.7㎝的凝胶条，将处理好的两根钢丝分别放入两端留出的凹槽中，向其中加入小苏打缓冲液至液面没过胶面约0.5㎝，再取四种颜色的色素（红，蓝，橙，绿），使用0.2ml滴管分别将一滴色素滴在塑料盒盖上，再用它取适量色素（用量约为0.2ml滴管的细管部分容积），将4种色素分别从盒盖上转移至凝胶的四个孔中，记录每个上样孔对应的色素颜色。

1.2.5电泳

调节适配器至35V，将电线一头正负极露出，把黑色鳄鱼夹引线连接在靠近点样孔的电极上，红色的接在另一个上，再把黑色鳄鱼夹引线与适配器黑色的导线相连，红色的与红色的相连，接通电源。若观察到缓冲液中有细小气泡升起，则电路连接成功，电泳开始。每隔半小时记录一次数据，直至色素条带迁移至距离胶孔约3-5㎝的位置。

2.探究琼脂浓度对凝胶电泳分离色素的影响

实验材料与实验一相同，实验过程除琼脂浓度分别为0.5%，1%，1.5%，2%，观察时间缩短至0.5h外，与实验一完全一致。

3.探究电源电压对凝胶电泳分离色素的影响

实验材料与实验一相同，实验过程除电源电压大小分别为15V，25V，35V，观察时间缩短至0.5h外，与实验一完全一致。

4.利用凝胶电泳技术进行DNA分子的提取与鉴定

4.1实验材料

香蕉，电子秤，纸垫，药匙，100ml量筒，250ml烧杯，研钵，洗涤剂，玻璃棒，氯化钠，纱布，手套，冰乙醇，蒸馏水，甘油，1ml滴管，0.2ml滴管，色素，小苏打，琼脂粉，胶梳，长方形塑料盒，金属丝，老虎钳，电源适配器，鳄鱼夹，刻度尺，亚甲基蓝等

4.2实验过程

4.2.1DNA的粗提

取60g左右的香蕉果肉放入研钵中，将其捣成流体状，加入18ml水制成香蕉流体，加入9ml洗洁精，缓慢搅拌5min，再加入5g氯化钠，继续搅拌5min。把双层纱布放在250ml干净烧杯上，过滤上述流体（可戴上手套挤压以加快过滤速度），静置10-15min，收集滤液并取20ml，置于50ml烧杯中，加入预冷的冰乙醇15ml，静置，用玻璃棒取出缓慢析出的白色絮状物质即DNA粗提物置于3ml蒸馏水中备用。

4.2.2DNA样品的处理

在3mlDNA溶液中，加入1ml甘油和六滴红色色素，混合均匀备用。

4.2.3电泳室制备

过程与实验一一致，不再赘述。电泳时间约为1h。

4.2.4凝胶染色

取亚甲基蓝浓溶液1ml放入250ml烧杯中，向烧杯中加入249ml的自来水，混合均匀，得到亚甲基蓝染色液。倒出电泳盒中的缓冲液，拿出钢丝，把亚甲基蓝染色液倒入电泳槽中，浸泡12h~36h后在光下观察现象。

五、实验结果

 实验一结果记录

实验二结果记录

实验三结果记录 

实验四结果记录（失败）

六、讨论

1.凝胶凝固时间过长

实验中1%的凝胶溶液经常被使用，通常其理论凝固时间为10~15min，而实际凝固时间要略长于该范围，经小组讨论，有可能是因为实验过程中加热步骤未完全加热凝胶溶液，导致其浓度降低，从而使凝胶难以凝固。

2.亚甲基蓝染色液未能成功染色

实验四中最后一步用亚甲基蓝染色液给胶板染色，理论上应能看出被染色的DNA条带，而在实验中经过48h都没有观察到，经小组讨论，有可能是因为在粗提DNA时没有使用预冷的冰乙醇，导致DNA析出量不足，其溶液浓度过低，进而导致难以染色。

七、结论

琼脂糖凝胶可用于电泳，其效果与琼脂浓度和电压大小有关，琼脂浓度在一定范围内越高，电压大小在一定范围内越大，电泳速度越快，且可利用这一技术进行DNA的分离。

八、参考文献

［1］陈采凤，王卫红，王小晶.高中生物学中DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳实验的整合［J］.生物学教学，2022，47（12）：63-64.

［2］刘兆霞，张顺仓.探究凝胶电泳实验中7个疑难问题［J］.中学生物教学，2022（22）：50-53.

［3］杨萍，陆嘉伟，李翠环.高效安全的核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中的应用［J］.实验室研究与探索，2022，41（07）：60-64.DOI：10.19927/j.cnki.syyt.2022.07.013.

［4］毛秀荣，李雷，朱俊等.浅析聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中常见问题及解决方法［J］.四川农业科技，2022（07）：95-96+102.

［5］张文刚，张妤，孙冰清等.凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定饲料添加剂溶菌酶二聚体的含量［J］.养殖与饲料，2021，20（07）：6-8.DOI：10.13300/j.cnki.cn42-1648/s.2021.07.003.

［6］柯兵兵，王德蓉，巫健翔等.琼脂糖凝胶电泳法测定静注人免疫球蛋白纯度［J］.中国医药工业杂志，2020，51（09）：1189-1193+1201.DOI：10.16522/j.cnki.cjph.2020.09.016.

［7］薄秀梅.核酸染色剂对DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移速度的影响［J］.安徽农业科学，2020，48（03）：1-3+10.

［8］黄嘉欣.可实现核酸快速凝胶的生物芯片流研究［D］.上海理工大学，2018.DOI：10.27308/d.cnki.gslgu.2018.000032.

［9］罗曼，将立科.新型琼脂糖凝胶电泳图像法测定动物细胞DNA［C］//中国生物化学与分子生物学会.中国生物化学与分子生物学会第八届全员代表大会暨全国学术会议论文摘要集.［出版者不详］，2001：409-410.

［10］沈斌彬.蛋白类生物的非还原十二烷基硫酸钠.毛细血管凝胶电泳分析［D］浙江大学，2021.DOI：10.27461/d.cnki.gzjdx.2021.002533