1.课题背景

1.1课题简介

我有幸在2023年秋旅行山西大同塞北高寒地区，发现该地区有一种高寒作物-燕麦，其制成的各式食品深受当地人喜爱，令人久久难忘。同时，燕麦的种植也引发了我浓厚兴趣，于是有了本次浅显的课题研究想法。

燕麦根系发达，是防止水土流失和提高贫瘠土地植被覆盖率的重要栽培牧草，其对非生物胁迫（盐碱、干旱、低温）具有较强的耐受性与适应性。由于高寒地区特殊的气候条件，加之干旱、低温等自然因素的影响，燕麦的生产受到限制，因此，提高其在恶劣环境中的产草量和品质迫在眉睫。本研究从绿色生态出发，选择2种内生真菌为研究对象，通过2种内生真菌发酵液浸种燕麦后将其种植在野外试验田中，研究不同内生真菌对燕麦的促生效果，并探究不同内生真菌对燕麦根部内生真菌群落结构的影响。

1.2课题说明

内生真菌是指定殖在健康植物组织内完成其全部或部分阶段的生活史，且不造成宿主明显病害的一类真菌。在长期协同发展进化过程中，内生真菌与植物形成互惠共利的关系。一方面，宿主植物能够提供内生真菌生长繁殖所必需的微环境和营养物质。另一方面，内生真菌可通过产生吲哚乙酸（indole-3-aceticacid，IAA）和减少乙烯合成促进植物种子萌发及根、茎、叶的生长，同时也能通过调节活性氧协助植物抵抗逆境胁迫。

2.实验过程

2.1材料与方法

1.试验地点

试验地点位于山西省大同市（海拔：2890.3 m，北纬39°54′~40°44′,东经112°06′~114°33′），该地属温带大陆性季风气候区，年平均气温6.4 ℃，年平均降水量为400 mm，土地类型为沉积黄土地。

2.试验材料

菌株ADK［木霉菌（Trichoderma rossicum），GenBank登录号： KR995112.1］分离自矮嵩草；菌株AF（F. luteovirens，GenBank登录号： EU365877.1）分离自黄绿卷毛菇子实体。

2.2试验设计与方法

1.真菌发酵液制备

菌株ADK在PDA固体培养基上活化5 d，取0.5 cm×0.5 cm的菌饼接种至PDB液体培养基，置于摇床150 r·min^-1，25 ℃培养7 d，备用。菌株AF在PDA固体培养基上活化20 d，取0.5 cm×0.5 cm的菌饼接种至PDB液体培养基，25 ℃静置培养30 d，备用。

2.试验设置及采样

在燕麦播种前，将燕麦种子在上述菌液中浸泡6 h后取出阴干。田间试验采用区组设计，播种方式为人工条播。除浸种燕麦菌液不同外，其他田间管理措施保持一致。在燕麦生长至3个月时，以S型取样法^［15］采集植株和相应的根际土壤，根际土壤采用抖根法^［19］获取，土壤样品过2 mm筛，去除土壤中的杂质，用于土壤理化性质分析。植物样品进行生长指标、生理指标测定和高通量测序。

3.生长指标测定

用卷尺、直尺和游标卡尺测量燕麦的株高、根长。用自来水冲洗植株根部，蒸馏水洗净后将其地上、地下部分自然风干后称其鲜重，然后105 ℃杀青20 min，于70 ℃烘干至恒重后称其干重。大田试验燕麦收获后进行燕麦产量测定。

4.生理指标测定

集燕麦植株新鲜叶片，用液氮研磨后，测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活性、维生素C（vitamin C，V_c）含量、脯氨酸（proline，Pro）含量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，每个处理重复3次。

5.土壤理化性质分析

采用烘干法测定土壤持水量^［19］，将土壤样品置于105 ℃的电热鼓风干燥箱，在土水比为1.0∶2.5的悬浮液中测定土壤pH^［20］。土壤全氮、全磷和总有机碳含量的测定分别采用凯氏定氮法、氢氧化钠碱熔-钼锑抗比色法和重铬酸钾容量法-外加热法^［21］。

植物根系DNA提取及Illumina Miseq测序称取0.5 g燕麦根系，采用CTAB法提取根系总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。

3.3数据分析

对高通量测序原始数据进行质筛，并在相似性97%的水平上，进行物种注释。

1.结果与分析

(1) 内生真菌浸种对燕麦生长和产量的影响

不同内生真菌浸种对燕麦生长和产量的影响不同，但ADK和AF浸种处理均能显著促进燕麦生长（P<0.05，表1）。ADK浸种处理显著提高了燕麦株高、根长、鲜重和干重（P<0.05），相比于对照（ACK），其株高和根长分别增加44.02%和15.55%。AF处理对燕麦产量的提高效果最为明显，与对照（ACK）相比产量提高了19.68%；ADK浸种处理也表现出较好的增产效果，增产率达12.13%。

内生真菌浸种对燕麦株高、根长、鲜重、干重和产量的影响

不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。

(2) 内生真菌浸种对燕麦生理生化指标的影响

内生真菌ADK和AF浸种处理均不同程度地影响燕麦丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、维生素C（V_c）含量和过氧化物酶（POD）活性（图1）。内生真菌ADK和AF浸种处理均能显著提高燕麦的过氧化物酶（POD）活性，相比于对照（ACK）分别增加87.53%和86.03%（P<0.05，图1A）。AF浸种处理对燕麦维生素C含量的增加效果最为显著，与对照（ACK）相比维生素C（Vc）含量提高了58.11%（图1B）。对照组（ACK）燕麦脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量均最高，分别为103.31 ug·g^-1和2.12 nmol·mg^-1 prot，而以ADK和AF浸种处理后燕麦脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量显著降低（P<0.05，图1C，D）。

图1   内生真菌浸种对燕麦生理生化指标的影响

不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

(3) 内生真菌浸种对燕麦根际土壤理化性质的影响

内生真菌浸种对燕麦大田土壤理化性状具有一定的影响（表2）。与对照（ACK）相比，ADK浸种处理显著降低了土壤全氮含量（P<0.05），其全氮含量降低32.65%。ADK和AF浸种处理提高了土壤全磷含量，分别提高了17.83%和3.88%。AF浸种处理土壤总有机碳的含量提升作用显著（P<0.05），较对照（ACK）增加15.82%。ADK和AF浸种处理还会在一定程度上改变土壤的pH值，其中AF浸种处理土壤pH比对照（ACK）高0.18。

内生真菌浸种对燕麦土壤理化性质的影响

(4) 内生真菌浸种对燕麦根系真菌多样性的影响

从ACK、ADK和AF浸种处理组燕麦根部样品中测得有效序列数分别为12480、28835和42860条，所形成的OTU数分别为18、98和359个。在相似度为97%条件下，Shannon指数由高到低依次为ADK>AF>ACK，Pielou指数表现为ADK>AF>ACK（表3），说明内生真菌ADK和AF浸种处理均能增加燕麦根系真菌多样性。

内生真菌浸种对燕麦根际真菌群落的α-多样性影响

(5) 内生真菌浸种对燕麦根系真菌群落结构的影响

ACK、ADK和AF共有OTU数为14，特有OTU数分别为2、29和288（图2A）。从真菌门含有物种的相对丰度Circos图可以看出（图2B），ACK根系真菌群落仅注释了3个门，依次为油壶菌门（Olpidiomycota，63.72%）、担子菌门（Basidiomycota，56.53%）和子囊菌门（Ascomycota，2.94%），而ADK和AF根系真菌群落共注释了5个门，优势菌门分别为担子菌门（66.53%）和油壶菌门（76.93%），说明内生真菌浸种增加了燕麦根系真菌群落组成。在科水平上（图2C），ACK、ADK和AF根系真菌群落分别注释了4、9和23科，壶菌科（Olpidiaceae）为ACK和AF浸种处理组的共同优势菌科，相对丰度分别占63.72%和6.93%，而ADK浸种处理组的优势菌科为红菇科（Russulaceae， 63.88%）。在属水平上（图2D），油壶菌属（Olpidium）为对照组（ACK）的第一优势属，乳菇属（Lactarius）为ADK的第一优势菌属；AF处理组的优势菌属主要有油壶菌属、乳菇属和Cystofilobasidium，相对丰度依次为76.93%、27.91%和

图 内生真菌浸种对燕麦根际真菌群落组成影响

A：OTU水平真菌群落组成Distribution of endophytic fungal communities at OTU level；

B、C：门和科水平真菌群落组成Distribution of endophytic fungal communities at phylum and family level， respectively；

D：相对丰度排名前10属真菌群落组成The top 10 genera with higher relative abundance.

（6） 内生真菌浸种对燕麦生长、生理、土壤理化性状和根系真菌群落的主成分分析

主成分分析（PCA）显示了用ACK、ADK和AF浸种处理燕麦对其生长、生理、根际土壤理化性状和根部内生真菌群落结构的PCA得分结果（图3）。PC1和PC2的贡献率分别为49.00%和23.72%，累计贡献率为72.72%。ADK处理组在PC1右侧，表明其在PC1水平为正相关。然而，ACK处理组在PC1左侧，意味着其在PC1水平呈负相关。此外，PCA结果显示，具有显著生长指标的数据均在PC1右侧，其对应ADK和AF处理组，表明内生真菌浸种燕麦可促进其生长、增强其抗逆性、增加其根部内生真菌多样性。

内生真菌浸种燕麦对其生长、生理、土壤理化性质和根部内生真菌群落影响的PCA分析

5.结论与讨论

研究发现内生真菌菌株不仅对植物生长有显著的促进作用，而且还可以显著增加宿主植物的株高、根长和生物量。本研究用两种内生真菌浸种燕麦发现株高、根长、鲜重、干重和产量相比于对照组均显著提高。在本研究中，内生真菌浸种通过提高燕麦过氧化物酶（POD）活性和维生素C含量，降低丙二醛和脯氨酸含量，从而提高燕麦的抗逆性。本研究中，内生真菌ADK和AF浸种燕麦POD活性显著高于对照（ACK），说明植物体内活性氧自由基的增加，提高了脂质过氧化物的含量，进而增强了燕麦对逆境胁迫的适应性。维生素C作为一种抗氧化剂，帮助植物抵抗干旱、臭氧和强紫外线，内生真菌AF浸种燕麦显著提高了维生素C含量，增强了燕麦的抗氧化性能。丙二醛含量可以影响细胞膜的功能和完整性，内生真菌ADK和AF浸种燕麦显著降低了MDA含量，说明内生真菌浸种能够缓解燕麦植株的细胞膜过氧化作用，减缓细胞膜受到的伤害。因此，内生真菌ADK和AF在促进植物生长和提高植物抗逆性方面有巨大的开发潜力。

内生真菌可以影响植物对氮、磷、碳的吸收，并会对土壤碳氮库等产生影响。其中，氮、磷和碳等含量可以直接体现土壤肥力和间接反映土壤分解矿物的能力，土壤pH会对土壤中化学元素的有效性产生影响，从而影响植物对营养物质的吸收。燕麦是一种抗逆性很强的植物，本研究结果显示，真菌浸种通过改变燕麦根际土壤pH和氮、磷、碳元素的含量来影响燕麦生长，其中，内生真菌ADK浸种对燕麦根际土壤氮、碳的影响最为显著，推测其为燕麦生长可能提供了部分营养物质，增强了其持久性。内生真菌会影响植物根际微生态环境，进而改变其微生物群落结构。此外，本研究发现内生真菌ADK浸种处理改变了燕麦优势属的组成，第一优势属为乳菇属。本研究结果表明内生真菌AF浸种处理后燕麦的产量显著提高，且根际真菌多样性增加。

内生真菌ADK和AF浸种处理后能够促进燕麦的生长与生理过程，改变燕麦根际土壤的理化性质，增加燕麦根部内生真菌多样性。其中，内生真菌ADK促进了燕麦生长，增加了燕麦根际真菌多样性；内生真菌AF提高了燕麦产量，增强了燕麦抗逆性。因此，这2种菌可作为燕麦专用生物改良剂的潜在菌种资源，为内生真菌菌剂开发利用提供了数据支持和思路。

参考文献

对ITS高变区片段作PCR扩增，选择引物序列为ITS1F（5′-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR扩增程序和扩增体系参考王桥美等［3］和唐慧敏等［22］的研究.