多角度研究细胞呼吸论文

邓惠仁邢亦彭程诗皓王悦洋陈冯意

指导老师：杨慧

徐州市第一中学

摘要：研究了细胞发酵速度影响因素、无细胞发酵以及酶活性影响因素，蔗糖浓度是细胞发酵速度的重要影响因素，无细胞结构的酵母提取液也能进行发酵，发酵与磷酸和镁离子有重要联系。温度、底物浓度、酶浓度、激活剂与抑制剂等都能影响酶活性。在生产生活中可以通过适当添加蔗糖以及磷酸盐和镁离子加快发酵速度，同时可以控制反应体系中的激活剂离子含量控制酶促反应速率。

关键词：发酵无细胞酶反应速率

一、   研究背景

细胞呼吸是生物体内最重要的生化反应之一。经过课内学习，我们对细胞呼吸有了初步的了解、认识。那么，还有哪些因素会对细胞呼吸产生影响？又是什么决定了有氧和无氧呼吸两种不同形式呢？本课题将以细胞呼吸为主线，探究其速率影响因素、发生条件、两种不同方式的决定因素等，对细胞呼吸进行更深入的了解。

二、  实验材料

试验仪器：本实验使用由徐州市第一中学科探方舟项目提供的显微镜、量筒（100mL）、胶头滴管、离心管、玻璃导管、剪刀、电子天平、研钵、点滴板、塑料小碗、烧杯，以及研究者自行提供的西门子冰箱。

试剂：石英砂、可溶性淀粉、硫酸铜、氯化钠、卢戈氏碘液、硫酸钠、活性干酵母、蔗糖。

三、  研究过程

1.底物浓度对酵母发酵的影响

1.1提出问题：

酵母发酵是生活中制作面食时的一种常用技术，而发酵时长与哪些因素有关？怎样才能达到更好的实验效果？

1.2知识了解：

1.2.1酵母发酵需要在有氧气，有水的环境下进行而且需要糖类作为反应底物。

1.2.2蔗糖的浓度，反应温度，氧气浓度等会影响酵母发酵的效果，我们选择蔗糖浓度这一因素进行探究。

1.3设置变脸

1.3.1蔗糖浓度为自变量，发酵效果（用发酵速度体现发酵效果，即用测定相同时间产生气体的体积进行测定）为因变量，因此，反应温度和氧气浓度就变成了无关变量，需要控制相同且适宜（即常温常压）。

1.4实验设计：

1.4.1配置浓度分别为0，10%，20%，30%的蔗糖溶液，注意浓度为0的蔗糖溶液要与其他组质量相等。

1.4.2检查装置气密性，连接排水集气装置。

1.4.3称取等量酵母（此处取2g），同时加入瓶中，迅速塞上瓶塞，每5min记录一次排水量，并做记录。

1.4.4实验束，整理试验仪器，分析数据。

1.4.5得出结论。

1.5做出假设

适量添加蔗糖可以加快酵母发酵，但当蔗糖浓度过高时会产生负面作用。

1.6实验步骤

1.6.1配置浓度分别为0，10%，20%，30%的蔗糖溶液。

1.6.2检查装置气密性，连接排水集气装置。

1.6.3称取等量酵母（此处取2g），同时加入瓶中，迅速塞上瓶塞，每5min记录一次排水量，并做记录。

 

实验图片

2.研究无细胞发酵过程

2.1提出问题

2.1.1无细胞发酵过程是怎样的？没有细胞，如何进行发酵？

2.2知识了解

2.2.1冷的干酵母更容易被研磨。

2.2.2理想气体状态方程：

PV=nRT

（P压强，V气体体积,n物质的量,R常数，T温度）

2.2.3发酵化学方程式：

C6H12O6+6O2+6H2O==12H2O+6CO2 

C6H12O6==2C2H5OH+2CO2

2.3实验设计

2.3.1称量1g冷冻后干酵母与1g石英砂充分研磨，然后加入5mL清水继续研磨。

2.3.2用显微镜观察到不再有完整的酵母细胞。

2.3.3用滤纸和烧杯过滤研磨液，取2mL滤液

2.3.4分别用5支针筒，分别加入不同组分的混合液，组分如下：

序号	1	2	3	4	5
水	0.5	-	0.5	-	0.5
10%蔗糖溶液	-	0.5	0.5	-	-
30%蔗糖溶液	-	-	-	0.5	0.5
酵母提取液（滤液）	0.5	0.5	-	0.5	-

 

2.3.5向皮管中加入含颜料的水，并把皮管连接到针筒上，记录初位置，每隔10分钟记录水柱位置，并做记录，到30min为止。

2.3.6分析数据，得出结论。

2.3.7交流讨论。

2.4做出假设

2.4.1蔗糖溶液中产生的气体较多，水柱移动较多，无蔗糖溶液中水柱移动较慢

2.5实验步骤

2.5.1称量1g冷冻后干酵母与1g石英砂充分研磨，然后加入5mL清水继续研磨。

2.5.2用显微镜观察到不再有完整的酵母细胞。

2.5.3用滤纸和烧杯过滤研磨液，取2mL滤液

2.5.4分别用5支针筒，分别加入不同组分的混合液，组分如下：

序号	1	2	3	4	5
水	0.5	-	0.5	-	0.5
10%蔗糖溶液	-	0.5	0.5	-	-
30%蔗糖溶液	-	-	-	0.5	0.5
酵母提取液（滤液）	0.5	0.5	-	0.5	-

2.5.5向皮管中加入含颜料的水，并把皮管连接到针筒上，记录初位置，每隔10分钟记录水柱位置，并做记录，到30min为止。

实验图片

3.探究酶活性影响因素

3.1提出问题：影响酶活性的因素有哪些？这些影响因素的效果如何?

3.2设计实验

3.2.1用蒸馏水漱口，吐出在试剂瓶中备用。

3.2.2分别制备1%淀粉溶液，1%NaCl溶液，6% NaCl溶液，0.1%CuSO4溶液， 7.5%Na2SO4溶液。.

3.2.3制备0.25%碘液与试剂瓶中备用

3.2.4将以下6支试管放入30-40℃热水中水浴，组分如下：

试剂	试管号	1	2	3	4	5	6
1%NaCl溶液（mL）		1	-	-	-	-	-
6% NaCl溶液（mL）		-	1	-	-	-	-
0.1%CuSO4溶液（mL）		-	-	-	1	-	-
7.5%Na2SO4溶液（mL）		-	-	1	-	-	-
水（mL）		-	-	-	-	1	2
1%淀粉溶液（mL）		3	3	3	3	3	3
唾液（mL）		1	1	1	1	1	-

3.2.515min后在试管中各取1mL与点滴板中，加入1滴碘液，观察实验现象并做记录

3.2.6分析数据，得出结论

3.2.7交流讨论

3.3做出假设

3.3.1一些试管中反应加快，一些反应减慢

3.4实验步骤

3.4.1用蒸馏水漱口，吐出在试剂瓶中备用。

3.4.2分别制备1%淀粉溶液，1%NaCl溶液，6% NaCl溶液，0.1%CuSO4溶液，7.5%Na2SO4溶液。.

3.4.3制备0.25%碘液与试剂瓶中备用

3.4.4将以下6支试管放入30-40℃热水中水浴，组分如下：

试剂	试管号	1	2	3	4	5	6
1%NaCl溶液（mL）		1	-	-	-	-	-
6% NaCl溶液（mL）		-	1	-	-	-	-
0.1%CuSO4溶液（mL）		-	-	-	1	-	-
7.5%Na2SO4溶液（mL）		-	-	1	-	-	-
水（mL）		-	-	-	-	1	2
1%淀粉溶液（mL）		3	3	3	3	3	3
唾液（mL）		1	1	1	1	1	-

3.4.515min后在试管中各取1mL与点滴板中，加入1滴碘液，观察实验现象并做记录

实验图片

 

3.4.6得出数据，分析数据

3.4.7交流讨论

四、结果与分析

1.探究底物浓度对酵母发酵的影响：

在三种不同浓度的蔗糖溶液中均发现排出液体，而清水中的酵母发酵效果差，没有发现排出气体。

1.1实验数据：

室温:28℃			发酵时长：30min
排水量（mL）	蔗糖浓度	CK（0）	10%	20%	30%
0min		0	0	0	0
5min		0	2	1.5	0
10min		0	17	4	1滴
15min		0	32	10	4滴
20min		0	56	24	6
25min		0	80	38	11
30min		0	已排完瓶中水	49	19

1.2数据分析

酵母发酵需要氧气，水和C6H12O6，其中任何一个过多或过少，都可能影响发酵效果，例如，蔗糖溶液浓度过高，可能会导致其中的H2O含量相对偏少，从而影响了发酵效果。

2.探究无细胞发酵过程

2.1实验结果

针筒编号	测量数据	0min液滴移动距离（mm）	10min液滴移动距离（mm）	20min液滴移动距离（mm）	30min液滴移动距离（mm）	是否有气泡
1		0	0	0	1	少许
2		0	2	4	5	有
3		0	0	0	0	无
4		0	0	1	1	极少
5		0	0	0	0	无

2.2数据分析

通过实验，研究者发现：在0-30min内，蔗糖浓度为10%，30%时可以观察到皮管里的液滴向外移动，100%蔗糖溶液中效果最明显，同时针筒内有气泡产生，以上现象说明酵母提取液可以进行发酵。质量分数为10%和30%的蔗糖溶液对发酵的影响有区别，具体表现为：10%蔗糖溶液中发酵更好。推测原因可能是：10%蔗糖溶液中含水量较多，只是蔗糖含量稍微较少，而30%蔗糖溶液中含水量太低，加上外界浓度过高，细胞渗透作用增强，对发酵起到抑制作用，所以比10%慢。

3.探究酶活性影响因素

3.1实验结果

试剂处理	序号	1	2	3	4	5	6
观察结果（* 越多代表蓝色越深。		*	***	*****	***	**	*****

3.2数据分析

通过实验，研究者发现： 6个试管的溶液反应后的蓝色由浅到深排序为： 152436。可判断出以上物质对唾液淀粉酶起促进作用的为： NaCl，对唾液淀粉酶起抑制作用的为： CuSO4、Na2SO4。CuSO4、Na2SO4即为唾液淀粉酶的抑制剂，NaCl为唾液淀粉酶的激活剂；随着氯化钠溶液的质量分数增高，对唾液淀粉酶的作用效果变化情况为质量分数增高，酶促反应先加快后减缓。推测本实验结果产生的原因可能是：钠离子和氯离子是激活剂，硫酸根离子是抑制剂，抑制作用比钠离子激活作用强。当氯离子浓度过高时，反应受到阻碍。

4.深入了解

研究者查阅相关资料，对研究的课题进行深入了解。

4.1有关细胞发酵

在细胞中，发酵过程与糖酵解过程极为类似，它们都是极为复杂的过程，发酵与糖酵解的差异就在于生成的丙酮酸的去向不同，发酵过程中生成乙醇与二氧化碳。发酵过程中，磷元素构成的磷酸作用巨大，主要有：

1.     使中间产物具有极性，不会通过脂膜失散

2.     起到信号作用，使酶与反应物结合

3.     形成ATP末端基团储能

研究者查阅资料后联想到使用含磷元素可食用物质是否可以加快发酵，于是积极上网查阅资料，发现使用食品添加剂Na(PO3)6可以缩短发酵周期。

4.2有关无细胞发酵

科学家曾做过实验，将酵母液透析。透析后的酵母液不能正常发酵，这说明有的与发酵有关的物质失去了。后来，发现是由发酵酶与辅酶I共同作用完成发酵过程。在发酵过程中，镁离子在发酵第一阶段（酵解准备过程）过程中起到至关重要的作用，它参与葡萄糖磷酸化（葡萄糖与ATP反应）、与磷酸果糖激酶一起参与1，6-二磷酸果糖的生成，还在第二阶段（葡萄糖→丙酮酸）中，与磷酸甘油酸激酶共同作用生成3-磷酸甘油酸，研究者由此想到可以考虑在进行发酵时添加镁离子增强酵母活性，从而大大加快发酵速度。研究者积极在网络上查阅资料，发现在啤酒酿造过程中确实会选择含镁离子的原料加快发酵速度。

4.3有关酶活性

酶通过与反应底物结合生成过渡态复合物而越过反应能障，从而降低活化能，使反应更易进行。酶活性受底物浓度、酶浓度、反应温度、激活剂、抑制剂等因素共同影响。研究者思考后认为，根据碰撞理论，不论增大酶浓度还是底物浓度，都能增多有效碰撞次数，使得反应加快。由反应速率常数可知：

k=Zexp（-Ea/RT）

（exp即e指数，R为摩尔气体常数，一般不变，T为绝对温度，Ea为活化能,Z表示1s每L体积内1mol反应物分子碰撞次数）

增大温度，也可以加快反应速率。

激活剂与抑制剂可以与酶结合或竞争从而加快或减慢反应速度。

5.拓展研究：关于有氧呼吸与无氧呼吸的决定因素的探究

5.1课题提出

研究者在进行酵母发酵实验过程中，整理实验仪器时，打开塞子，闻到一股酒味，联想到学过的有氧呼吸与无氧呼吸的知识：有氧呼吸到底与无氧呼吸差别在哪里？有些生物只能进行无氧呼吸是由于缺少哪些必要因素呢？接下来，本组决定对有氧呼吸和无氧呼吸在呼吸酶、反应所需元素以及有氧呼吸对生物发展的意义方面的探究。

5.2知识了解

为了更好了解有氧、无氧呼吸机制，研究者对有氧呼吸、无氧呼吸过程进行了资料查阅。

5.2.1.糖酵解过程

糖酵解过程中主要涉及的酶包括己糖激酶、磷酸己糖异构酶、磷酸果糖激酶（此过程需要镁离子参与）、醛缩酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油激酶（此过程需要镁离子参与）、磷酸酶、丙酮酸激酶（此过程可以合成ATP）等酶参加。

5.2.2.丙酮酸生成乳酸的过程

此过程需要乳酸脱氢酶参与，最终反应产物为乳酸。

5.2.3.丙酮酸生成乙醇的过程

此过程需要

i）           丙酮酸脱羧酶参与，在动物细胞中不存在此酶，以硫胺素焦磷酸（TPP）为辅酶，此过程生成乙醛。

ii）         乙醇脱氢酶参与反应，催化乙醛反应生成乙醇。

5.2.4.柠檬酸循环过程

此过程中，先由丙酮酸在丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰转乙酰酶和二氢硫辛酰脱氢酶的作用下转化为乙酰-CoA，进而参加柠檬酸循环过程。此过程中TPP作为辅助因子之一参与反应。

接着，乙酰-CoA与草酰乙酸在柠檬酸合酶催化下缩合成柠檬酸，然后柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶复合体等的催化下进行柠檬酸循环，在此过程中，分别由其中代谢合成的6NADH、2FADH2、2GDP产生15ATP、3ATP、2ATP，实现放能过程，以传递质子的形式放出[H]，进而参加有氧呼吸第三阶段反应。

5.2.5.氧化磷酸化过程

在此过程中，NADH-Q还原酶等发挥了重要作用（Q代表醌类化合物），此外，铁元素在呼吸链电子传递中起到重要作用（Fe-S辅助因子）。

5.2.6.以上涉及的重要物质的结构与性质

i)硫辛酸，分子式为C8H14O2S2，是一种有机化合物，可作为辅酶参与机体内的物质代谢中的酰基转移，能消除导致加速老化与致病的自由基。硫辛酸在体内经肠道吸收后进入细胞，兼具脂溶性与水溶性的特性。

ii)醌是含有共轭环己二烯二酮或环己二烯二亚甲基结构的一类有机化合物的总称。大部分的醌都是α,β-不饱和酮，且为非芳香、有颜色的化合物。最简单的醌是苯醌，包括对苯醌（1,4-苯醌）和邻苯醌（1,2-苯醌）。

iii)TPP：即硫胺素焦磷酸。其分子的重要特点是它的噻唑环上氮原子与硫原子之间的碳原子与通常所见的CH基团相比，表现出更强的酸性，它可离子化生成负碳离子，后者容易接受a-酮酸或酮糖的的羰基，而带正电荷的氮原子作为一个电子库（election sink）对于稳定负碳离子以及a-酮酸的脱羧作用起重要作用，由于这些酶对于糖代谢具有十分重要的作用，故与糖的分解供能过程关系密切

5.3做出假设

5.3.1能否进行有氧呼吸的二、三阶段，主要是由细胞中是否含有与之相关的酶决定的。

理由：由于其中的一些酶由于需要一些复杂的有机化学反应才可以完成，比如醌类化合物就需要由苯酚由于羟基的活化作用，被氧化剂氧化成对苯醌，此过程需要较高等生物体内的四苯基卟啉作用下由光照和氧气氧化，在一些低等生物体内是缺乏反应条件的，所以无法进行有氧呼吸二、三阶段。

5.3.2能否进行有氧呼吸的二、三阶段，主要是由周围环境中是否含有与有关结构形成的元素以及元素含量是否充足决定的。

理由：由于生物起源于海洋，海洋中富含硫、氮元素，故形成TPP、硫辛酸在化学元素守恒层面讲，是可能的。事实证明，硫辛酸、TPP确实在糖酵解过程中发挥作用。而铁元素由于含量较低或极少，不足以形成呼吸链中传递电子的重要结构，无法进行有氧呼吸。

5.4设计实验

为验证猜想二是否合理，参与者尽己所能提出了一套初步实验方案。

5.4.1实验材料：土壤浸出液、稀盐酸、氢氧化钠、植物叶肉细胞、培养皿、水、烧杯、药匙重铬酸钾试液等

5.4.2实验过程：

i）取10mL土壤浸出液，将土壤浸出液平均分成两份，每份5mL，测定pH值。向第一份中滴定1mol/L稀盐酸调控pH至3.7，过滤氢氧化铁沉淀。再加入适量氢氧化钠，将浸出液pH调至与原浸出液相等。向第二份中加入与第一份加入氢氧化钠等物质的量的氯化钠，加水至二者体积相等。

ii）取适量植物叶肉细胞，分两组加入培养皿中，用两种试液分别培养，保证通风。一段时间后，分别滴加重铬酸钾试液观察现象

5.5结果分析：

若在去除铁离子的培养液中，试液由橙红色变为灰绿色，原浸出液中试液不变色，说明有可能是由于铁的缺乏导致重要结构合成受阻导致。

5.6实验反思：

设计本实验的目的是为了探究铁元素在有氧呼吸作用中的作用，但该实验存在一些问题。该实验只能说明存在由于缺铁导致呼吸受阻的可能性。本实验通过研究缺少铁离子情况下是否会出现无氧呼吸现象来探究，一定程度上排除了由缺铁导致的其他因素对植物代谢的影响（如果只观察植物生长是否正常，可能是由于缺铁导致其他生理活动受阻而变现为生长代谢不正常，而测是否乙醇则可以说明是由于没有进行有氧呼吸二、三阶段而被迫进行无氧呼吸）。但本实验中无法避免的问题：

i）由于在滴定过程中添加HCl与NaOH，故无法保证浸出液中的NaCl含量与土壤中一致。

ii）无法保证植物由于叶绿素缺少铁被破坏分解或其他一些结构功能被破坏而引起一些功能异常产生乙醇。

五、结论

1.探究酵母发酵速度

发酵速度最快的是10%的蔗糖溶液。质量分数为10%、20%、30%的蔗糖溶液能够促进酵母菌发酵。在清水中酵母缺少发酵所需的C6H12O6故不能快速发酵。此实验设置的处理中，在质量分数为10%的蔗糖溶液下，添加2g酵母，发酵情况最佳。

2.探究无细胞发酵

酵母提取液可以进行发酵。10%蔗糖溶液中发酵更好。推测原因可能是：10%蔗糖溶液中含水量较多，只是蔗糖含量稍微较少，而30%蔗糖溶液中含水量太低，加上外界浓度过高，细胞渗透作用增强，对发酵起到抑制作用，所以比10%慢。

3.探究酶活性影响因素

CuSO4、Na2SO4。CuSO4、Na2SO4为唾液淀粉酶的抑制剂，NaCl为唾液淀粉酶的激活剂；随着氯化钠溶液的质量分数增高，对唾液淀粉酶的作用效果变化情况为质量分数增高，酶促反应先加快后减缓。原因可能是：钠离子和氯离子是激活剂，硫酸根离子是抑制剂，抑制作用比钠离子激活作用强。当氯离子浓度过高时，反应受到阻碍。

六、参考文献

1.葛明德、吴相钰、陈守良《陈阅增普通生物学（第4版）》[M]，高等教育出版社.2014

2.朱圣庚、徐长法《生物化学（第4版）》[M]，高等教育出版社.2017