[细胞发酵与无细胞发酵差异及

影响酶活性因素探究]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

姓			名      王小可       张博雅
指	导	教	师     闻婧
学			校   徐州市第一中学
日			期     2021年10月15日

 

 

 

[细胞发酵与无细胞发酵差异及

影响酶活性因素探究]

王小可   张博雅

指导教师闻婧

 

【摘要】本课题探讨了有关发酵的历史，对发酵的认识。研究谈论并总结了细胞发酵和无细胞发酵的差异，也探究了影响酶活性的诸多因素。通过第一个实验，发现不同浓度的蔗糖溶液对相同质量的酵母发酵效果是不同的。底物浓度会对发酵效果产生影响，并非是浓度越大效果越好，而是合适的浓度对发酵的效果最佳。第二个实验皮管中的液体之所以会移动，是因为酵母提取液和蔗糖溶液反应。酵母液经过研磨和过滤后不存在活酵母，说明活力物质不需要酵母菌存在，在体外照样可以发挥催化作用，会产生发酵现象。第三个实验发现氯化钠、硫酸钠对唾液淀粉酶起促进作用。硫酸铜对其起抑制作用。根据实验及材料确认，0.1%的硫酸铜为唾液淀粉酶抑制剂，7.5%硫酸钠溶液为唾液淀粉酶激活剂。酶的活力受温度、PH、酶的浓度、底物浓度、激活剂和抑制剂等因素的影响。

【关键词】发酵；细胞；无细胞；激活剂；抑制剂

一、研究背景

早在几千年前，发酵就出现在人们的生活中，人们积累了很多发酵的经验，而人们对发酵奥秘的探索则是经历了漫长的研究和总结。

在诺贝尔奖的获奖名单上，毕希纳是个了不起的人物，他曾因付不起学费而辍学，却凭借对科学的钟爱和不辍地研究探索，终于打开了生物化学的神圣大门。在他打工期间，对发酵的过程产生了浓厚的兴趣。他那个时代，人们对于发酵的认识十分浅显，认为各种发酵物是自然产生的。显微镜问世后，研究人员纷纷对“自然发生说”提出质疑。许多人认为发酵是单纯的化学反应。法国科学家巴斯德发现了发酵过程都是由不同的发酵菌引起的，是一种生物学过程。冯 李比希则认为发酵是一种单纯的化学反应。后来，毕希纳将酶和酵素两个概念合并，解决了关于发酵的争论。之后，关于发酵机理之争层出不穷。毕希纳意外地发现无细胞发酵为现代生物化学研究打开了新的领域。酶成为一项研究的主流。

在学科研究的道路上，总会出现一些错误的观点，这正是人们认识世界的的必经之路。在研究中批判地担待观点，提出质疑，研究解决问题，才能够有新的发现和结论。本研究的目的是为了进一步明确细胞发酵与无细胞发酵的差异，找出影响酶活性的因素，更好地利用发酵的相关知识，为生产生活创造便利。

二、实验材料

实验一材料：

显微镜、载玻片、盖玻片：徐州市第一中学紫金校区实验室

电子天平、剪刀、橡皮管、90度玻璃导管、60度玻璃导管、离心管、100毫升塑料瓶、吸管、单双孔橡胶塞、蔗糖、活性干酵母：科探方舟实验盒

实验二材料：

显微镜、载玻片、盖玻片：徐州市第一中学紫金校区实验室

电子天平、剪刀、皮管、石英砂、研钵、滴管、吸管、点滴板、离心管、针管、染料溶液、滤纸、蔗糖溶液、记号笔：科探方舟实验盒

实验三材料：

100毫升塑料瓶、卢戈氏碘液、点滴板、电子天平、搅拌棒、滴管、量杯、离心管、汤匙、可溶性淀粉、氯化钠、硫酸铜、温度计：科探方舟实验盒

三、研究过程

实验一：底物浓度对酵母细胞发酵效果的影响探究

实验步骤如下：

1.显微镜下观察酵母菌

A 样液制备：取约0.1克酵母放入10毫升离心管，向离心管加入5毫升水，用吸管吹打混匀得到样液。B显微镜观察：取一滴样液滴加在载玻片上，轻轻盖上盖玻片，在显微镜下观察，并记录酵母情况。

2.搭建简易排水集气装置

A 连接导管：用3厘米的橡胶管，把两个90度导管连接起来，导管的两端分别插入单孔橡胶塞和双孔橡胶塞其中一孔，使导管末端在橡胶塞内漏出2毫米。B放置装置：取60度导管10厘米端口插入双孔橡胶塞剩余一孔，使其末端在瓶内长度约为瓶内长度的三分之二，5厘米端口下放置10毫升离心管，用来收集液体。C装置调整：用橡胶塞将两个100毫升塑料瓶和导管连接起来，将两个导管调整为同一高度。           

3.溶液配制

取4个100毫升塑料瓶，在塑料瓶中分别配制质量分数为清水、10%、20%、30%的蔗糖溶液各20毫升。贴上标签。另取4个100毫升塑料瓶，装入100毫升清水。

4.加入酵母，开始发酵

用电子天平分别称取4份2克活性干酵母，依次置于质量分数为清水、10%、20%、30%的蔗糖溶液中，快速盖上橡胶塞，轻轻晃动瓶子混匀，静置发酵并计时。

5.观察与记录

于发酵5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟时，分别记录10毫升离心管收集的液体体积。

6.将得到数据填入表中

实验二：探究无细胞发酵的过程——复现诺奖经典实验

实验步骤如下：

1.酵母处理及研磨（无冰箱或冰袋情况下操作）

研磨：用电子天平称取1克活性酵母，置于研钵中，加入1克石英砂，研磨约5分钟。观察：取少量研磨物置于点滴板的一个槽里，加5滴水，混匀，吸取1滴置于载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察，看到较多酵

母菌细胞，需向研钵中重复刚才的操作，直至在显微镜下看到较少的细胞。

2.制备破碎酵母提取液

过滤：取一张滤纸，十字折叠，使其成为滤斗状，放置于30毫升塑料瓶口，过滤酵母混合液。

3.检测提取液中是否存在活酵母

吸取一滴过滤液在载玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察，看到较多酵母菌细胞，需重新过滤，直至在显微镜下看不到酵母细胞。

4.针筒皮管准备

取5支5毫升针筒，用记号笔标记1-5，剪5段10厘米的皮管。

5.染料溶液准备

取30毫升塑料瓶，向瓶中加入约10毫升清水，滴入一滴颜料，混匀。

6.注入蔗糖溶液及酵母提取液

将针筒塞拔出，用滴管向每个针筒中加入对应添加物，放入针筒塞，使针筒小口端朝上，将针筒塞推至3毫升刻度处。

7.皮管内注入染料溶液

用滴管吸取制备好的染料溶液，从一段滴入皮管，注入液滴体积占皮管2毫米，使皮管竖立，轻轻敲动，使液滴下落至距离皮管口1厘米处

8.做标记

将带有液滴的皮管装在针筒上，水平放置于桌面，静置5-10分钟。对液滴在皮管的位置做标记。

9.观测与记录

在反应0、10、20、30分钟时在皮管上记录液滴移动的方向和距离。30分钟后卸下装置。

实验三：探究影响酶活性的因素

实验步骤如下：

1.唾液淀粉酶的准备

用蒸馏水漱口，除去食物残渣，含一口约20毫升蒸馏水于口中，轻漱一分钟，吐入100毫升塑料瓶内，加入20毫升蒸馏水。

2.制备所需试剂

1%淀粉制备、1%NaCl溶液制备、6 %NaCl溶液制备、 0.1%CuSo4溶液制备、0.75%Na2So4溶液制备

3.碘液的准备

取5%卢戈氏碘液0.5毫升置于离心管中，用蒸馏水稀释至10毫升得到实验用碘液

4.添加相应试剂于离心管

取6支10毫升离心管，依次标号为1-6，并按要求将相应试剂加入离心管。

5.酶促反应

取一个塑料小碗，放入30-40度的温水，水量约小碗的三分之一，用温度计测温，将6支离心管放置于塑料碗中，计时15分钟，期间使水温保持在30-40度之间。低于30度要加些热水。

6.测定

在每个点滴板的凹槽边标上数字1-6，依次用滴管取出两滴相应试管反应液滴入凹槽。

7.滴加碘液，观察结果

向点滴板的凹槽中依次滴加1滴碘液，查看凹槽中的溶液蓝色深浅，若各组没有显著差异，则说明还在反应中，需等待5-10分钟，直至各组间有比较明显的差异。

8.将数据记录，进行处理分析

四、结果与分析

实验一：底物浓度对酵母细胞发酵效果的影响探究

 

在实验中，对蔗糖、酵母的称量，实验器材的摆放和安装都要细致入微。一直过了10来分钟四组实验都没有收集到任何液体，只有个别组有瓶内有蔗糖和酵母的混合反应，到了15分钟时，含量10%的蔗糖溶液反应较剧烈，含10%的蔗糖溶液旁的离心管开始收集液体，随后含量20%的蔗糖溶液也开始有液体溢出，而且速度越来越快。30%的蔗糖液与酵母混合液的瓶内也有反应，但30分钟内始终没有液体溢出。不添加蔗糖的清水与酵母混合，反应不明显，也没有收集到任何液体。在实验过程中，10%的蔗糖液体瓶上口出现轻微漏气现象，用医用胶布粘贴后情况好转，但也在一定程度上影响了实验结果。

通过上图可以看出，通过实验，我发现不同浓度的蔗糖溶液对相同质量的酵母发酵效果是不同的。最先发生反应和收集到液体的是10%的蔗糖溶液，0-30分钟内，20%的蔗糖溶液反应速度和集液量随着时间的增加而增加。到达30分钟时，浓度为0和30%的蔗糖溶液未收集到液体。10%的蔗糖溶液反应效果是最好的。但就瓶内反应情况而言，含量为30%的蔗糖溶液瓶内反应大于含量为0的蔗糖溶液。实验过程中，浓度10%的实验装置出现少许漏气现象，会在一定程度上影响实验结果。底物浓度会对发酵效果产生影响，并非是浓度越大效果越好，而是合适的浓度对发酵的效果最佳。

 

实验二：探究无细胞发酵的过程——复现诺奖经典实验

 

 

 

首先把实验所需器材准备好。按照无冰箱或冰袋的情况下使用的操作，对活性酵母进行研磨。之后经过多次在显微镜下观察，发现有极少的酵母细胞后开始制作酵母提取液。酵母提取液为乳黄色的液体，约2毫升的滤液。实验中最难操作的是将带有红色液滴的皮管安装到针筒上。这个步骤稍不留神，红色液滴便会“逃跑”。起初几次都是失败的，又再观看视频讲解实验步骤，仔细观察学习，最终把皮管套在了针头上。经过观察，发现2号和4号针管内有气泡。也是这两个皮管内的液体移动距离较大。3号管的液体有回退现象。1号皮管内液体移动不明显。5号皮管内液体先回退后往前移动。

皮管中的液体之所以会移动，是因为酵母提取液和蔗糖溶液反应。酵母液经过研磨和过滤后不存在活酵母，说明活力物质不需要酵母菌存在，在体外照样可以发挥催化作用，会产生发酵现象。

实验三：探究影响酶活性的因素

 

各种溶液配制好以后分别贴上标签，待配制好碘溶液以后，我小心翼翼按照要求向离心管添加各种溶液。之后开始进行酶促反应的实验。最初准备的温水温度达到了50度，又添加了三次冷水，温度才符合要求。将离心管放入温水中等待了15分钟，由于天气炎热，中途没有加热水，温度始终保持在30-40度之间。将离心管内溶液和碘液滴在凹槽中，发现凹槽中的液体发生了不同程度的色变。6号离心管内液体和碘液结合，显现的蓝色颜色较深，3号管其次。颜色最浅的是2号管。

通过实验，我发现：6个离心管的溶液反应后的蓝色由浅到深依次为6号管、3号管、4号管、1号管、5号管、1号管。发现氯化钠、硫酸钠对唾液淀粉酶起促进作用。硫酸铜对其起抑制作用。根据实验及材料确认，0.1%的硫酸铜为唾液淀粉酶抑制剂，7.5%硫酸钠溶液为唾液淀粉酶激活剂。

五、结论

通过实验一我们发现：不同浓度的蔗糖溶液对相同质量的酵母发酵效果是不同的。最先发生反应和收集到液体的是10%的蔗糖溶液，0-30分钟内，20%的蔗糖溶液反应速度和集液量随着时间的增加而增加。到达30分钟时，浓度为0和30%的蔗糖溶液未收集到液体。10%的蔗糖溶液反应效果是最好的。但就瓶内反应情况而言，含量为30%的蔗糖溶液瓶内反应大于含量为0的蔗糖溶液。底物浓度会对发酵效果产生影响，并非是浓度越大效果越好，而是合适的浓度对发酵的效果最佳。

通过实验二我们发现：在0-30分钟内，蔗糖浓度为10%和30%的皮管里的液滴向外移动，同时针管内有气泡产生。说明酵母提取液可以进行发酵。酵母液经过研磨和过滤后不存在活酵母，说明活力物质不需要酵母菌存在，在体外照样可以发挥催化作用，会产生发酵现象。质量分数10%的蔗糖溶液和30%的蔗糖溶液发酵情况有区别。10%浓度的蔗糖溶液和酵母汁发酵效果更好，液滴移动距离更大。

通过实验三我们发现：6个离心管的溶液 反应后的蓝色由浅到深依次为6号管、3号管、 4号管、1号管、5号管、1号管。发现氯化钠、硫酸钠对唾液淀粉酶起促进作用。硫酸铜对 其起抑制作用。根据实验及材料确认，0.1%的硫酸铜为唾液淀粉酶抑制剂，氯化钠溶液 为唾液淀粉酶激活剂。酶的本质是蛋白质。产生的、对其底物具有高度特异性和高度催 化效能的蛋白质或RNA。酶是一类极为重要的生物催化剂，由于酶的作用，生物体内的 化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。酶的活力受温度、PH、酶的浓度、 底物浓度、激活剂和抑制剂等因素的影响。

六、参考文献

期刊类

【1】张倩雯，王春霞，杨丽芸等影响酿酒酵母发酵过程的因素分析[j].中国酿造，2015,34（12）:20-25

【2】陈文秀，董守亮，杨鹏飞等.影响酒精酵母发酵效果的因素研究[j]现代食品，2017,5（9）:104-106

【3】Eduard Buchner; Cell-free fermen tati.Nobel  Lecture ,December 11,1907

书籍类

【1】【法】帕特里斯 德布雷。巴斯德传【M】、姜志辉，译。商务印书馆，1994

附录